Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Анализ методом ПЦР – это диагностический метод, позволяющий выявить наличие возбудителя заболевания в организме даже, если он присутствует в минимальных количествах.

В зависимости от вида исследования различается стоимость проведения ПЦР, в комплексе они дешевле. Примерные цены по Москве:

Название анализа

Стоимость, рублей

Инфекции, передающиеся половым путем

400

Вирусы Эпштейна-Барра, папилломы человека, герпеса, цитомегаловируса

300–500

Качественный анализ гепатита

650

Количественный анализ гепатита

2000

Антитела к вирусам гепатита, суммарные и иммуноглобулины

450

Хеликобактер пилори

350

Антигены и антитела к ВИЧ

400

Качественные РНК ВИЧ

3500

Количественные РНК ВИЧ

11500

Классификация используемых флуорофоров

Неспецифичесое определение: количественная ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное внедряться в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Определение продукта можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green. Однако красители двухцепочечных ДНК(дцДНК) будут связываться со всеми дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера). Это может потенциально помешать точности мониторинга целевой последовательности[6].

Специфическое определение: флуоресцентный репортерный зонд кПЦР с использованием флуоресцентного зонда

Флуоресцентные зонды обнаруживают только ДНК-содержащую последовательность, комплементарную зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно повышает специфичность и позволяет повысить точность измерения в присутствии других дцДНК. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймера, которые могут подавлять накопление целевых продуктов реакции[7].

Можно также использовать несколько зондов, у которых флюорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке зарегистрировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественной ПЦР (англ. multiplex PCR)[8].

Метод основан на введении комплементарного продукту амплификации ДНК-зонда с флуоресцентным репортером на одном конце зонда и гасителем флуоресценции на противоположном. Когда гаситель находится в непосредственной близости от репортера, он поглощает сигнал и репортер не даёт флуоресценции. Во время амплификации целостность зонда нарушается и репортер можно обнаружить по флуоресценции после возбуждения лазером. Следовательно, увеличение количества продукта, с которым связывается репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции. Метки могут флуорессцировать в фазе элонгации или в фазе отжига ПЦР[4].

  • Метки, работающие в фазе элонгации:

На зонд с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии они будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК-полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью (часто используется Taq-полимераза), по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флюорофор, и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится[4].

  • Метки, работающие в фазу отжига:
  1. Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать особую пространственную структуру ДНК — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдёт пространственное разнесение флуорофор]а и его гасителя и восстановление флуоресценции. Регистрацию целесообразно проводить после денатурации[4].
  2. Метка, основанная на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флюорофор-донор и флюорофор -акцептор, соответственно. При их близком расположении флюорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флюорофор-акцептор и испускает регистрируемый свет.[4].

Когда назначается ПЦР-диагностика?

Анализ методом ПЦР проводится при подозрении на конкретную инфекцию.

ПЦР-диагностика назначается при подозрении на инфекции, вызывающие тяжелые заболевания (прежде всего, инфекции, передающиеся половым путем). В этих случаях важно убедиться, находится ли инфекция в организме или нет, то есть важно само присутствие вируса, а не его активность. Однако метод ПЦР позволяет анализировать и количественные характеристики, поэтому с его помощью можно оценивать интенсивность патологических процессов, протекающих скрыто и не доступных иным методам диагностики.

Также с помощью ПЦР оценивается эффективность лечения: удалось ли полностью избавиться от возбудителя заболевания или насколько удалось снизить его присутствие.

Метод ПЦР используется также при диагностике онкологических (раковых) заболеваний.

ПЦР крови в диагностике гепатита

В последнее время анализ крови на гепатиты методом полимеразной реакции (ПЦР) все чаще назначается пациентам с подозрением на заболевание.

Анализ крови на гепатит методом ПЦР дает возможность решить такие задачи:

  • Выявить протекающий инфекционный процесс на раннем сроке развития, в период сероконверсионного окна — до появления в организме антител.
  • Уточнить отсутствие вирусной патологии, когда другие иммуноферментные анализы предоставили неоднозначные результаты.
  • Обнаружить вирусоносителя среди серопозитивных пациентов.
  • Дает возможность точно определить тип гепатита.

Полимеразная реакция определяет ДНК вируса путем исследования образца венозной крови или пунктата печени.

Диагностика может определить гепатит как количественно, так и качественно.

Количественный анализ крови способом ПЦР дает понять врачу о вирусной нагрузке на организм, определяя количество частиц вируса.

Интерпретация (расшифровка) ПЦР крови на гепатит В или С может быть следующей:

Положительный результат 

  • Вируснаходится в стадии обострения или протекает в хронической форме. Выявление «дикого» штамма вируса.
  • Заражение вирусом гепатита В или С мутантного типа. (HBsAg: отрицательно, анти-HBcor: положительно).
  • Ложноположительное заключение (анти-HBcor: отрицательно).

Отрицательный результат

  • На данный момент инфицирование вирусом отсутствует.
  • Пребывание острой формы вируса в инкубационном периоде.
  • Период восстановления/выздоровления.

Исследование крови на гепатит методом ПЦР рекомендуется в случае:

  • Повышения уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартат-аминотрансферазы (АсАТ), выявленного в ходе биохимического анализа крови.
  • Как часть обследования перед подготовкой к зачатию или хирургическому вмешательству.
  • Когда пациент регулярно подвергается инъекциям внутривенного характера.
  • Если у пациента был незащищенный сексуальный контакт, особенно при наличии подозрений о протекающем вирусе у партнера.
  • Если у пациента присутствуют клинические признаки заболевания.

Анализ крови на гепатит С и другие типы методом ПЦР проводится с использованием метода Real-Time.

Провести диагностику уже можно спустя 14 дней после предполагаемого инфицирования.

Виды ПЦР

С помощью ПЦР на гепатит выявляют возбудителя вирусного воспаления печени. Однако анализ востребован и при выявлении отцовства. Также исследование используется в криминалистике.

Если предстоит диагностика гепатита С, врачи используют несколько разновидностей анализа ПЦР:

  1. Качественный анализ на гепатит. Исследование показывает наличие или отсутствие вируса в крови. У качественного исследования есть настройки чувствительности. Если патогена в крови менее 10МЕ (международных единиц) на миллилитр, результат исследования отрицательный. Верхняя граница чувствительности равна 500 МЕ на миллилитр.
  2. Гепатит С количественный анализ. Его ещё называют исследованием на определение вирусной нагрузки. Определяют число РНК вируса гепатита C. Количественный анализ тоже проводится на 1 миллилитре крови пациента.

Качественный анализ проводится перед-, либо во время лечения. С помощью исследования врачи находят ответ на 3 вопроса. Во-первых, определяется степень риска передачи возбудителя от больного человека здоровому. Во-вторых, проверяется эффективность проводимого лечения. Третий ответ, «вытекающий» из результатов ПЦР — время, необходимое для терапии гепатита С.

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)

полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP)short tandem repeats (STR)однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)Рис. 6. Схема системы для ДНК MassArray™ методаprimer oligo base extension reaction (PROBE)

дидезоксинуклеотидов (ddNTPs)Рис. 7. Схема PROBE-реакции (продукты элонгации различаются по массе на один нуклеотид)Рис. 8. Результат SNP-анализа (гетерозиготный образец) с использованием PROBE-реакции (два SNP-аллеля дают два четко различимых масс-сигнала)Рис. 9. Данные микросателлитного анализа (гетерозиготный образец) с использованием PROBE-реакции. Сигналы, отмеченные звездочкой, соответствуют фрагментам прерывания синтеза

Полимеразная цепная реакция Задачи

Итак, при ПЦР размножается только участок, ограниченный праймерами. Сразу понятно, как получить множество копий нужного гена для генно-инженерных целей: надо просто подобрать такие праймеры, которые будут ограничивать нужный участок. Праймеры эти должны быть уникальны и не повторяться больше нигде в геноме.

В принципе, та же задача стоит при выяснении наличия данного гена у данного вида живых существ. Если гена нет, ДНК размножаться не будет. Было ли размножение или его не было, можно будет понять, добавив к ПЦР-смеси краску, которая будет светиться при связывании с ДНК.

Таким же образом выясняется наличие или отсутствие инфекционного заболевания. Подбираются праймеры под какой-нибудь уникальный ген возбудителя, и если этот ген размножился в образце, значит возбудитель в нем присутствовал.

Прекрасно, но как же тогда определить мутацию в гене? Ведь сам ген будет присутствовать в геноме в любом случае — мутантный или нет.

Решение этой проблемы очень изящно и отличается для снипов и инсерций-делеций. Начнем со снипов.

Снип — это изменение в один нуклеотид. Чтобы понять, есть оно в данном гене или нет, мы подберем праймеры так, чтобы снип был внутри праймера. В результате если снип есть, то кусок ДНК будет размножаться, а если нет — то и нет.

Хорошо, но как тогда разобраться с крупными изменениями ДНК — инсерциями и делециями? Бывает ведь, что при мутации выпадают или вклиниваются повторяющиеся участки ДНК — то есть в нормальном гене, допустим 4 повтора данного участка, а в мутантном — 2 или, наоборот, 7. Как в этом случае подобрать праймер — ведь участки будут идентичны?

В этом случае мы подберем праймеры, которые будут окружать интересный нам участок с двух сторон. И когда этот участок размножится, мы прогоним продукты ПЦР на электрофорезе — эта методика позволяет разделить фрагменты ДНК по размеру. Короткий участок будет означать наличие делеции (или, наоборот, отсутствие инсерции), а длинный — отсутствие делеции (или, наоборот, наличие инсерции).

И наконец — родственники и преступники. Родственные связи и корни преступных событий с помощью ПЦР выясняются очень похожим способом. Дело в том, что в ДНК каждого человека есть особые повторяющиеся участки — микросателлиты.

Однако у каждого человека эти микросателлиты разбросаны в своих участках генома; сходство в их распределении тем больше, чем ближе родственные связи между обладателями исследуемой ДНК.

Если мы поставим ПЦР с праймерами на этих участках, то в результате получим уникальное распределение длин получившихся отрезков ДНК — генетический отпечаток пальца. У родственников такие «отпечатки пальцев» будут тем более похожи, чем ближе родство.

Если же нам повезет обнаружить на месте преступления ДНК преступника, то нам достаточно будет сравнить его «отпечаток пальца» с «отпечатками пальцев» подозреваемых.

Расшифровка результатов

Окончательный результат исследования выдается через 1 – 2 суток после сдачи биологического материала. Нередко – уже в первые сутки после анализа.

Качественный анализ

  • Отрицательный результат означает, что в веществе, сданном на исследование, следов возбудителей инфекции не обнаружено.
  • Положительный результат означает выявление патогенных вирусов или бактерий в биологическом образце с очень высокой степенью точности на момент сдачи материала.

Если результат положительный, но признаков активизации инфекции не выявлено – такое состояние организма называют бессимптомным «здоровым носительством». Чаще всего наблюдается при взятии биоматериала из определенного места (цервикальный канал, уретра, полость рта) при вирусных заболеваниях. Лечения в этом случае не требуется, но обязательно постоянное врачебное наблюдение, поскольку существует вероятность:

  • распространения вируса от носителей и заражение здоровых людей;
  • активизации процесса и переход заболевания в хроническую форму.
Читайте также:  Белый налет на языке и бородавки на языке

Однако — если положительным является анализ крови, это указывает на то, что инфекция поразила организм, и это уже не состояние носительства, а патология, требующая незамедлительной специфической терапии.

Количественный результат определяет специалист конкретно для определенного вида инфекции. На его основании можно оценить степень развития, стадию болезни, что дает возможность оперативно назначить правильное лечение.

ПЦР при беременности

Анализы на скрытые вирусные инфекции помогают выявить заболевание и предотвратить патологии развития плода. ПЦР мазок при беременности может выявить скрытую инфекцию гепатита, причем, другие методы диагностики не способны справиться с задачей. Анализ выделений организма беременной позволяет выявить наличие скрытых паразитирующих микроорганизмов, которые внешне себя не проявляют.

Герпес при беременности

Данный вирус, раз попав в тело человека, остается там навсегда. Во время снижения иммунной защиты, вирус переходит из спящей фазы в активную. Во время беременности защита иммунитета снижается, поэтому вероятность агрессии герпеса увеличивается.

Чем опасен герпес для беременных? Крайней степенью агрессии вируса является поражение внутренних органов тела. Причем, опасна любая форма герпеса — оральная и генитальная. Анализ крови берут у всех беременных женщин.

Герпес способен проникать через плаценту и поражать плод. Известны случаи самопроизвольного выкидыша, гибели младенца после рождения и преждевременных родов, вызванные активностью герпеса. Малыш может заразиться во время прохождения по родовым путям матери.

Анализ полимеразной цепной реакции способен обнаружить вирус герпеса даже в малых количествах в слизистых оболочках органов, а также установить его вид — оральный/генитальный.

Диагностику на наличие герпеса необходимо проводить в следующих случаях:

  • перед планированием оплодотворения;
  • при предшествующих новому зачатию выкидышах;
  • при наличии высыпаний на наружных половых органах;
  • при определении причин бесплодия.

В случае хронического течения инфекции анализ позволит установить степень опасности заражения вирусом полового партнера.

Цитомегаловирус

Особенно опасной считается цитомегаловирусная инфекция, попавшая в тело матери в первые 10 недель формирования плода. Нередко цитомегаловирус приводит к прерыванию беременности и выкидышу.

Инфицирование в срок от трех месяцев до полугода приводит к различным отклонениям в развитии плода, замедлению роста и дисплазии внутренних органов. Заражение на последних месяцах вынашивания приводит к поражению органов ребенка, которое можно увидеть уже после рождения.

Устранить цитомегаловирусную инфекцию невозможно, однако, сдержать ее активную форму удается с помощью курса терапии. Беременным назначают медикаменты, способствующие укреплению иммунной системы: в этом случае организм сам борется против агрессии вируса.

Передается вирус разными способами:

  • в организм матери вирус попадает при общении с зараженным человеком и во время полового контакта;
  • от матери плоду бактерии передаются через плаценту, в процессе родов и при грудном вскармливании.

Цитомегаловирус может проявить себя через два месяца после проникновения в тело женщины, симптомы похожи за простудное заболевание:

  • гипертермия и озноб;
  • головные боли;
  • бронхит и кашель;
  • боли в мышцах и костях.

Нельзя приписывать расстройство здоровья беременной ее особому состоянию. Нельзя назначать лечение самостоятельно без консультаций с гинекологом. Проявления заболеваний могут носить одинаковый характер, но различную этимологи.

К мерам защиты от цитомегаловируса относится:

  • защищенный секс с постоянным партнером;
  • использование индивидуальной посуды;
  • использование индивидуальных предметов личной гигиены;
  • дозированная физическая нагрузка на организм;
  • сбалансированная диета, прием витаминов;
  • позитивный настрой и прогулки на улице.

ПЦР мазок на цитомегаловирус способен защитить мать и плод от тяжелых последствий развития недуга.

Диагностика вирусных и бактериальных инфекций методом ПЦР

  • Методом ПЦР можно определить наличие ВИЧ-инфекции в организме.
  • Наличие ВИЧ — инфекции  также является одним из условий, при которых необходима сдача ПЦР анализа на вирус герпеса.
  • Обследование поможет обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту за небольшой промежуток времени.
  • Для проведения исследования дополнительно может использоваться такой биологический материал, как мазок из уретры.
  • Перед процедурой отбора пациенту следует воздержаться от мочеиспускания в течение нескольких часов.